Диссертация Нгуен Минь Ли

Нгуен Минь Ли (Nguyen Minh Ly)

Молекулярно-генетическое изучение устойчивости к киле brassica rapa l.

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук, доцент
Монахос Сократ Григорьевич

Москва – 2014

Информация о соискателе и диссертации
ФИО соискателя: Нгуен Минь Ли (Nguyen Minh Ly)
Гражданство соискателя: Вьетнам
Дата рождения: 29.11.1986 г.

Название диссертации: Молекулярно-генетическое изучение устойчивости к киле brassica rapa l.

Шифр и название специальности: 06.01. 05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений
Соискание степени: кандидата сельскохозяйственных наук
Где выполнялась работа: ФГБОУ ВО РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ -МСХА ИМЕНИ К.А. ТИМИРЯЗЕВА в 2012-2014 гг.

Дата защиты: 25.03.2015
Заключение диссовета после защиты

Текст диссертации: Диссертационная работа Нгуен М.Л.
Дата публикации диссертации: 17.11.2014
Автореферат: Автореферат Нгуен Минь Ли
Дата публикации автореферата: 21.01.2015

Научный руководитель
ФИО: Монахос Сократ Григорьевич
Ученая степень: кандидат сельскохозяйственных наук, доцент
Место работы: ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева», заведующий кафедрой селекции и семеноводства садовых культур

Отзыв научного руководителя

—
Оппонент 1
ФИО: Игнатов Александр Николаевич
Ученая степень: доктор биологических наук
Место работы: ФГБУН Центр «Биоинженерия» Российской академии наук, заведующий лабораторией молекулярной фитопатологии
Отзыв оппонента: положительный
Дата публикации отзыва: 10.03.2015
—
Оппонент 2
ФИО: Домблидес Артур Сергеевич
Ученая степень: кандидат сельскохозяйственных наук
Место работы: ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур, заведующий сектором молекулярно-генетический исследований лаборатории генетики и цитологии
Отзыв оппонента: положительный
Дата публикации отзыва: 10.03.2015
—
Ведущая организация
Название: Российский государственный аграрный заочный
университет
ФИО руководителя, заверившего отзыв: Дубовик В.А., ректор
№ протокола и дата: протокол №5 от 20.02.2015
Отзыв организации: положительный
Дата публикации отзыва: 27.02.2015
—
Другие отзывы на автореферат и диссертацию:

1. Отзыв 1
2. Отзыв 2
3. Отзыв 3
4. Отзыв 4
5. Отзыв 5

Описание работы

Актуальность темы исследования. В настоящее время в ситуации сильной конкуренции на рынке семян капустных культур селекционные компании стремятся к повышению своей конкурентоспособности за счёт применения инновационных биотехнологических методов в селекционном процессе. При этом отмечается большое значение методов маркер — опосредованного отбора или селекции с помощью молекулярных маркеров (Brumlop S., Finckh M.R., 2010; Narasimhulu R. et al., 2013) и создания растений удвоенных гаплоидов (Takahashi Y. et al., 2011; Zhang Y. et al., 2012).

Среди овощных капустных культур особое место занимает капуста пекинская (Brassica rapa L. subsp. pekinensis (Lour.) Hanelt), которая представляет собой приоритетную культуру во многих странах восточной Азии, Америки, Австралии и т.д. (Wang X., 2011). В России она также становится более популярной. В мировой практике производства капусты пекинской большой ущерб наносят разные вредоносные заболевания. Одной из них является кила, борьба с которой возможна только методом создания устойчивых сортов и гибридов F1 (Монахос Г.Ф., Монахос С.Г. 2009а).

В селекции капусты пекинской на устойчивость к киле в течение более двадцати лет проводят интенсивные работы по созданию и внедрению молекулярных маркеров генов устойчивости, так как только с помощью маркеров можно пирамидировать несколько генов в одном генотипе для обеспечения высокой и надежной устойчивости к болезни.

В пределах вида B. rapa с помощью молекулярных маркеров выявлено, по меньшей мере, восемь локусов устойчивости к киле Crr1 (Kikuchi М. et al., 1999), Crr2 (Suwabe K. et al., 2003), Crr3 (Hirai M. et al., 2004), Crr4 (Suwabe K. et al., 2006), CRa (Hayashida N. et al., 2008), CRb (Piao Z. et al., 2004), CRc, Crk (Sakamoto K. et al., 2008), которые локализованы на 5 группах сцепления. Несмотря на определенные успехи, конечная цель пока еще не достигнута — до сих пор отсутствуют универсальные маркеры локусов устойчивости для использования в практике селекционного процесса. Таким образом, работа по поиску высокоэффективных генов устойчивости к киле и разработке их эффективных молекулярных маркеров для ускорения и повышения эффективности селекционного процесса на устойчивость к возбудителю килы Plasmodiophora brassicae Wor. остается актуальной.

В современных условиях в селекции F1 гибридов капустных культур, а также генетических исследованиях широко применяют метод культуры микроспор для получения чистых линий удвоенных гаплоидов. На завершающем этапе этой технологии для определения плоидности полученных растений-регенерантов может быть использован подсчет числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, однако, сведений относительно стабильности проявления данного признака и силе его связи с числом хромосом растений в изменяющихся условиях среды у различных культур недостаточно и представляется актуальной проблемой.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явились изучение и разработка системы маркер-опосредованного отбора капустных растений по признаку устойчивости к киле и уровню плоидности для применения в практической селекции.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Изучить генетику устойчивости к киле линий капусты пекинской и линий европейского турнепса, как доноров генов устойчивости;
2. Оценить эффективность опубликованных молекулярных маркеров картированных локусов устойчивости к киле в расщепляющихся популяциях коллекции линий капусты пекинской и турнепса;
3. Изучить и создать высокоспецифичный молекулярный SCAR маркер тесно связанный с геном устойчивости к киле;
4. Определить генетическое положение в группе сцепления генетической карты B. rapa маркированного локуса устойчивости к киле;
5. Провести скрининг наличия/отсутствия выявленного SCAR маркера гена устойчивости в коллекции устойчивых и восприимчивых к киле инбредных линий и F1 гибридов капусты пекинской, и в отдаленных скрещиваниях между B. oleraceaи гибрида (B. rapa×B. napus).
6. Изучить эффективность использования признака «число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц» для дифференциации растений видов Brassica, различающихся по уровню плоидности.

Научная новизна

На коллекции инбредных линий капусты пекинской и европейского турнепса дана оценка эффективности отдельных генов устойчивости к киле B. rapa.

С помощью высокоспецифичного и тесно сцепленного с одним из генов устойчивости SCAR маркера Tau_cBrCR404 проведена дифференциация линий капусты пекинской по генам устойчивости и выявлены линии пригодные для поиска и разработки маркеров других генов устойчивости к киле B. rapa.

В генетической коллекции капусты пекинской и европейского турнепса выявлен новый ранее неизвестный высокоэффективный ген устойчивости к киле, картированный в 5-й группе сцепления B. rapa и обозначенный CrrA5.

Впервые на генотипах капустных растений B. rapa, B. oleracea и B. napus представлены данные о зависимости проявления признака «число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц» от внешнего фактора (температура воздуха), стадии онтогенетического развития (возраст растения) и биологии растения (продолжительность вегетационного периода), а также его связь с уровнем плоидности растений.

Теоретическая и практическая значимость

Разработан высокоэффективный ДНК маркер пригодный для маркер-опосредованного отбора в селекционных программах, направленных на создание устойчивых к киле капустных культур.

Получены уточненные данные по наследованию устойчивости к киле и уровню обеспечиваемой устойчивости отдельными генами инбредных линий капусты пекинской и линий европейского турнепса.

Охарактеризована эффективность опубликованных молекулярных маркеров известных картированных локусов устойчивости к киле B. rapa.

Получены сведения о новом ранее неизвестном гене устойчивости к киле CrrA5 и его локализации в 5-й группе сцепления B. rapa.

Представлены данные об эффективности применения метода подсчета числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и стабильности проявления данного признака у капустных культур.

Методология и методы исследования

Для изучения генетики устойчивости киле использовали метод оценки устойчивости к киле на инфекционном фоне (Монахос Г.Ф. и др., 2009b).

Работу по маркированию генов устойчивости проводили с помощью метода выделения ДНК — ЦТАБ (Murray M.G., Thompson W.F., 1980), метода массового сегрегационного анализа (BSA) (Michelmore R.W. et al., 1991), полимеразной цепной реакции (ПЦР), электрофореза, клонирования фрагмента ДНК и секвенирования ПЦР продукта. Для определения степени сцепления между маркером и геном и картирования локуса устойчивости использовали программу MapDisto 1.7.6.5.1.1 (XL2010) (Lorieux M., 2012).

Определение числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и числа хромосом в клетках меристематических тканей кончиков корешков и в делящихся клетках пыльников молодых бутонов проводили цитологическим анализом (Savitsky H., 1966; Пухальский В.А. и др., 2007).

Положения, выносимые на защиту:

1. Наследование устойчивости к киле инбредных линий капусты пекинской моногенное доминантное, инбредных линий европейского турнепса — полимерное доминантное;
2. Разработанный высокоспецифичный ДНК маркер Tau_cBrCR404, позволяет дифференцировать устойчивые и восприимчивые генотипы капусты пекинской в расщепляющихся популяциях и в генетических коллекциях, является эффективным в маркер-опосредованном отборе;
3. Маркированный ген устойчивости к киле CrrA5 капусты пекинской (линия 20-2сс1-132) располагается на A05 группе сцепления B. rapa и является новым, ранее неизвестным;
4. Число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц является стабильным в проявлении маркерным признаком тесно связанным с плоидностью растений капустных культур B. rapa, B. oleracea и B. napus, а подсчет числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц – высокоэффективным методом оценки плоидности растений капусты пекинской, капусты белокочанной и рапса.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Статистическую обработку полученных данных фенотипического расщепления в изучении генетики устойчивости к киле проводили с помощью критерия хи-квадрата.

Достоверность различий числа хлоропластов под влиянием различных факторов, температуры среды, возраста и уровня плоидности растения, определяли с использованием доверительного интервала на основе t-распределения Стьюдента при уровне значимости 0,05 (Доспехов Б.А., 1985) и программу Microsoft Exсel 2010.

Основные положения работы были представлены на научной конференции молодых ученных и специалистов РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2012; 2013); международной научно-практической конференции (VI Квасниковские чтения) в ГНУ ВНИИ овощеводства Россельхозакадемии (Московская обл., 2013); XI молодежной научной конференции: Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии (Москва, 2011);  международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученных МГУ имени М.В. Ломоносова (Москва, 2011; 2010); научной конференции студентов РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2009; 2010; 2011); Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученных аграрных вузов Центрального федерального округа (Курск, 2011).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертационного исследования опубликовано 10 работ, в том числе 3 в рецензируемых научных журналах и изданиях для опубликования основных научных результатов диссертаций ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Объем работы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, рекомендаций, списка сокращений, содержит 15 таблиц, 44 рисунка, 11 приложений. Список литературы включает 183 наименования, в том числе 157 работ иностранных авторов.