Чистова Анастасия Викторовна
Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук, доцент
Монахос Сократ Григорьевич
Москва – 2014
Информация о соискателе и диссертации
ФИО соискателя: Чистова Анастасия Викторовна
Гражданство соискателя: РФ
Дата рождения: 11.12.1989 г.
Название диссертации: Совершенствование in vitro технологии получения удвоенных гаплоидов для селекции F1 гибридов моркови на основе самонесовместимости.
Шифр и название специальности: 06.01. 05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений
Соискание степени: кандидата сельскохозяйственных наук
Где выполнялась работа: в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева» на кафедре селекции и семеноводства садовых культур в 2011-2014 гг.
Дата защиты: 21.05.2015
Текст диссертации: Диссертационная работа Чистовой А.В.
Дата публикации диссертации: 17.11.2014
Автореферат: Автореферат Чистовой А.В.
Дата публикации автореферата: 20.01.2015
Научный руководитель
ФИО: Монахос Сократ Григорьевич
Ученая степень: кандидат сельскохозяйственных наук, доцент
Отзыв руководителя
Место работы: ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева», заведующий кафедрой селекции и семеноводства садовых культур
—
Оппонент 1
ФИО: Шмыкова Наталья Анатольевна
Ученая степень: доктор сельскохозяйственных наук
Место работы: заведующая лабораторией биотехнологии
ГНУ ВНИИССОК Россельхозакадемии
Отзыв оппонента: положительный
Дата публикации отзыва: 20.03.2015
—
Оппонент 2
ФИО: Бутов Илья Станиславович
Ученая степень: кандидат сельскохозяйственных наук
Место работы: редактор-журналист журнала «Картофель и овощи»
Отзыв оппонента: положительный
Дата публикации отзыва: 19.03.2015
—
Ведущая организация
Название: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов» (изменено Протоколом №3/1п от 25 марта 2015 г.)
ФИО руководителя, заверившего отзыв: Кирабаев Н.С.
№ протокола и дата: №9 от 16.04.2015
Отзыв организации: положительный
Дата публикации отзыва: 30.04.2015
—
Другие отзывы на автореферат и диссертацию:
- Отзыв 1 Кимсанбаев
- Отзыв 2 Басиев
- Отзыв 3 Калашникова
- Отзыв 4 Бохан
- Отзыв 5 Ветчинкина
- Отзыв 6 Кирина
- Отзыв 7 Штуц
- Отзыв 8 Боева
- Отзыв 9 Никитина
Описание работы
Роль овощей, бахчевых культур, фруктов в продовольственном балансе определяется их значимостью для здоровья и долголетия людей. Являясь важным компонентом пищевого рациона человека, овощи и фрукты благоприятно действуют на обмен веществ и обладают лечебными свойствами. Климатические условия России благоприятны для выращивания всех овощных и бахчевых культур, и страна сама может обеспечить свое население этими видами продукции. Вместе с тем в стране складывается хронический дефицит потребления отечественных овощных и бахчевых культур в рационе питания населения (Пивоваров В.Ф. с соавт., 2009; Сирота С.М. с соавт., 2009).
По данным Федеральной службы государственной статистики потребление овощей и бахчевых культур, в 2012 году в среднем на человека составило 99,6 кг (Федеральная служба государственной статистики, www.gks.ru), тогда как в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 2 августа 2010 г. рекомендуемая норма потребления составляет 120 — 140 кг/год/чел с учетом их использования в том числе для производства пищевых продуктов, блюд и напитков (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Минздравсоцразвития России) от 2 августа 2010 г. N 593н г. Москва «Об утверждении рекомендаций по рациональным нормам потребления пищевых продуктов, отвечающим современным требованиям здорового питания», www.rg.ru). При этом по данным ГНИЦ профилактической медицины Минздрава России НИИ питания РАМН фактическое потребление овощей на душу населения составляет 72 кг/год, а Всемирная Организация Здравоохранения рекомендует медицинскую норму потребления овощей и бахчевых культур 210 кг на душу населения в год.
Морковь (Daucus carota L. var. sativus Hoffmn.) является главной овощной культурой семейства Зонтичных, широко возделываемой по всему миру (Леунов В.И., 2011). Эта культура имеет большое экономическое значение, так как возделывается на обширной территории, в 2012 году в мире было произведено 36 917 245 тонн моркови и репы (FAOSTAT statistics database, http://faostat3.fao.org). Возделывание моркови имеет глубокие традиции как в Европе, так и в Азии (Stolarczyk J., 2011).
Морковь обладает ценными диетическими качествами. В питании человека играет важную роль в сыром, в переработанном виде, а также в фармацевтической промышленности. В питании человека эта культура — важнейший источник витаминов, пектинов, сахаров, минеральных веществ. Морковь содержит 9,0 мг/100 г β-каротина, симметрично расщепляющийся ферментативно на две молекулы витамина А, при его суточной дозе 6-8 мг, суточная доза β-каротина содержится в 78 г моркови. Биодоступность пищевых каротиноидов зависит от характера содержащего их продукта. Так, всасываемость β-каротина из сырой моркови, в клетках которой он находится в форме кристаллов, составляет 17–25%, тогда как всасываемость из шпината, где он связан с хлоропластами, – только 5–10% (Дадали В.А., 2010). Морковь содержит также небольшое количество аскорбиновой кислоты 5±1 мг/100 г (Кошелева О.В., 2013).
Важным достоинством корнеплодов моркови является возможность их хранения и потребления в течение всего года. Морковь используют в свежем виде и в качестве компонента множества блюд. В переработанном виде морковь входит в состав соков, однокомпонентных и многокомпонентных овощных консервов, замороженных полуфабрикатов, используется для изготовления пищевых красителей желтых оттенков для кондитерской промышленности.
Семена моркови используют в фармацевтической промышленности для производства препаратов Даукарин, применяемого при коронарной недостаточности и стенокардии, и Уролесан, применяемого при мочекаменной и желчекаменной болезни. Масло семян моркови обладает антисептическим, противовоспалительным действием, входит в состав косметических средств для ухода за кожей, смягчения рубцовой ткани, используется для лечения дерматозов и экземы. Морковь широко применяют в народной медицине (Машковский М.Д., 2005; Справочник лекарств РЛС, http://www.rlsnet.ru).
По данным FAOSTAT в 2011 году в Российской Федерации было произведено 1 735 030 тонн моркови и репы и импортировано еще 266 326 тонн, в 2012 году было произведено 1 565 032 тонны (FAOSTAT statistics database, http://faostat3.fao.org), что указывает на необходимость повышения эффективности сельскохозяйственного производства для достижения самообеспечения и продовольственной безопасности страны. Важная роль в этом вопросе отводится селекции и семеноводству.
Овощеводство – высокотехнологичная отрасль, предъявляющая высокие требования к возделываемым сортам и F1 гибридам (внешний вид, однородность и выравненность корнеплодов, высокая товарность продукции, лежкость корнеплодов, устойчивость к основным патогенам). Существует устойчивая тенденция внедрения в практику F1 гибридов, отличающихся высокой продуктивностью и товарностью.
По количеству выращиваемых гибридов морковь занимает ведущие позиции в сравнении с другими культурами (Леунов В.И., 2011). Благодаря явным преимуществам гибридов в 2014 году в Государственном реестре селекционных достижений из 237 наименований моркови представлено 118 F1 гибридов (Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. Том 1. Сорта растений (по состоянию на 28.02.2014 г.), http://www.gossort.com). По данным FAOSTAT, Российская Федерация является одним из лидеров по производству моркови и репы, при этом лидирующие позиции в гибридной селекции и семеноводстве моркови занимают иностранные фирмы. Ключевой проблемой конкурентоспособности отечественной селекции и семеноводства Пивоваров В.Ф. (2012) называет производство высококачественных репродукционных семян овощных культур.
Актуальность темы исследования. Для получения F1 гибридов моркови необходимы чистые линии, которые классическими методами селекции создают путем инбридинга (принудительного самоопыления) и отбора в течение 6-7 поколений, то есть 12-14 лет. Кроме того, в гибридном семеноводстве используется мужская стерильность, требующая получения изогенных пар, стерильной линии и закрепителя стерильности, на создание которых может быть потрачено столько же или больше лет. Таким образом, селекция F1 гибридов моркови с применением классических методов является сложным и длительным процессом.
Разработка и вовлечение в селекционную работу современных биотехнологических приемов, в частности, методов культуры пыльников и изолированных микроспор, а также разработка прогрессивных генетико-селекционных схем на основе альтернативных способов получения гибридных семян позволят существенно ускорить селекцию F1 гибридов моркови. Так, в частности, только применение технологии получения линий удвоенных гаплоидов позволит исключить необходимость многих поколений самоопыления и уменьшить срок получения гомозиготных линий до 1-2 лет (Li J.-R., 2013), при этом увеличить интенсивность селекционного процесса.
Созданию удвоенных гаплоидов моркови посвящено несколько работ (Andersen S.B. et al., 1990; Hu K.L. et al., 1993; Matsubara S. et al., 1995; Górecka K. et al., 2005; Zhuang F. et al., 2010), в том числе и отечественных ученых (Шмыкова Н.А., 2006; Тюкавин Г.Б., 2007), описывающих применение технологии культивирования пыльников, микроспор (Górecka K., et al., 2010; Ferrie A.M.R. et al., 2010; Li J.-R. et al., 2013;) и семяпочек (Домблидес А.С., 2001; Kiełkowska А. et al., 2010; Котлярова О.В., 2010).
При этом каждый из авторов отмечает узкие места технологий, в значительной степени снижающие выход растений-регенерантов – удвоенных гаплоидов, такие как: технологические сложности выделения пыльников, длительный период культивации до инициирования эмбриогенеза и каллусогенеза, низкая эффективность получения эмбриоидов, растений-регенерантов и адаптированных к нестерильным условиям растений, различие в плоидности получаемых растений.
Цель и задачи. Целью данной работы является оптимизация технологий получения и микроклонального размножения линий — удвоенных гаплоидов при интеграции их в генетико-селекционную схему создания F1 гибридов моркови на основе самонесовместимости.
Достижение цели предполагает решение следующих задач:
1) оптимизировать технологию получения удвоенных гаплоидов в культуре изолированных пыльников: определить ключевые морфологические параметры цветковых бутонов, соответствующие определенной стадии развития микроспор; изучить влияние температурной обработки на эффективность эмбрио- и каллусогенеза; выявить оптимальный состав питательной среды для получения эмбриоидов и каллуса из пыльников; изучить возможность использования культуры изолированных микроспор в производстве удвоенных гаплоидов моркови; оптимизировать методы определения плоидности и гомозиготности растений-регенерантов.
2) оптимизировать технологию микроклонального размножения для репродукции самонесовместимых родительских линий моркови: изучить возможность введения в культуру в зависимости от этапа онтогенеза донорного растения; изучить эффективности размножения — эмбриогенеза и регенерации в каллусной и суспензионной культуре клеток; определить хронологический регламент изоляции эксплантов и введения в культуру для интеграции технологии в селекционно-семеноводческую схему.
3) Разработать генетико-селекционную схему создания F1 гибридов моркови на основе самонесовместимости.
Научная новизна. Показана высокая степень проявления самонесовместимости линий, завязываемость 0,4 семян/соцветие при самоопылении и 138,9 семян/соцветие при перекрестном опылении.
Установлено, что на питательной среде В5 с 500 мг/л глутамина, 100 мг/л серина, 500 мг/л гидролизата казеина, 0,1 мг/л 2,4-D и 0,1 мг/л NAA при культивировании пыльников эмбриоиды и каллус могут быть получены у 42,5% высаженных пыльников.
Температурная обработка введенных в культуру пыльников моркови +32ºС в течение 2 дней повышает способность пыльников формировать эмбриоиды и каллус до 5,8-88,3% в зависимости от генотипа и состава питательной среды.
Показано проявление самонесовместимости у растений моркови и предложена схема производства гибридных семян на ее основе.
Практическая значимость. Разработана генетико-селекционная схема создания F1 гибридов моркови на основе самонесовместимости с интегрированными биотехнологическими методами создания линий – удвоенных гаплоидов и микроклонального размножения родительских линий.
Оптимизированная технология культуры пыльников моркови позволяет получать до 103,3 растений-регенерантов со ста высаженных пыльников.
Установлен оптимальный для репродукции родительских линий моркови метод микроклонального размножения и срок их введения в культуру.
Положения, выносимые на защиту:
- Строгое проявление самонесовместимости у растений моркови позволяет использовать данное явление в гибридном семеноводстве и является основой для разработки генетико-селекционной схемы производства F1 гибридов моркови, включающей интеграцию методов получения и размножения линий — удвоенных гаплоидов.
- При производстве удвоенных гаплоидов моркови в культуре пыльников оптимизированный состав питательной среды (В5 с 500 мг/л глутамина, 100 мг/л серина, 500 мг/л гидролизата казеина, 0,1 мг/л 2,4-D и 0,1 мг/л NAA) обеспечивает до 42,5% пыльников, формирующих эмбриоиды и каллус.
- Инкубирование введенных в культуру пыльников при температуре +32ºС в течение 48 часов в темноте повышает эффективность андрогенеза в культуре пыльников в среднем в 2,6 раза.
- Основные элементы интегрированной в генетико-селекционную схему технологии микроклонального размножения: тип экспланта – любая доступная живая неинфицированная ткань, сроки введения в культуру – конец декабря, метод культуры – суспензионная культура клеток.
Апробация результатов. Результаты исследований доложены и обсуждены на 5 конференциях: Международная научная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная созданию объединенного аграрного вуза в Москве (Москва, 2014 г.); Международная научная конференция, посвященная 150-летию академика В.Р. Вильямса (Москва, 2013 г.); Научная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 170-летию со дня рождения К.А. Тимирязева (Москва, 2013г.); XIII молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2013 г.); Научная конференции молодых ученных и специалистов, посвященная 125-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Москва, 2012 г.).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемом научном журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста, содержит 21 таблицу, 20 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов, выводов, рекомендаций производству, приложений. Библиографический список включает 125 источников, в том числе 88 на иностранных языках.
