Диссертация Корчагин А.В.

Корчагин Антон Владимирович

Разработка технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской (Pelargonium grandiflorum (ANDREWS) WILLD.) в культуре микроспор

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Поляков А.В.

Москва – 2015
Информация о соискателе и диссертации
ФИО соискателя: Корчагин Антон Владимирович
Гражданство соискателя: РФ
Дата рождения: 15.08.1986 г.

Название диссертации: Разработка технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской (Pelargonium grandiflorum (ANDREWS) WILLD.) в культуре микроспор

Шифр и название специальности: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений
Соискание степени: кандидата сельскохозяйственных наук

Где выполнялась работа: в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт овощеводства» в группе северного овощеводства в 20**-20** гг.
Дата защиты: 17.12.2015 10:00 МСК
Текст диссертации: Диссертационная работа Корчагина А.В.
Дата публикации диссертации: 08.09.2015
Автореферат: Файл автореферата
Дата публикации автореферата: 12.10.2015

Научный руководитель
ФИО: Поляков Алексей Васильевич
Ученая степень: доктор биологических наук, профессор
Место работы: ФГБНУ ВНИИО

Отзыв руководителя

—
Оппонент 1
ФИО: Соловьев Александр Александрович
Ученая степень: доктор биологических наук
Место работы: ФГБОУ ВО Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева, декан факультета агрономии и биотехнологии, заведующий кафедрой генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства
Отзыв оппонента: положительный
Дата публикации отзыва: 30.11.2015

—
Оппонент 2
ФИО: Пугачева Галина Михайловна
Ученая степень: кандидат сельскохозяйственных наук, доцент
Место работы: ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства имени И.В. Мичурина»
Отзыв оппонента: положительный
Дата публикации отзыва: 20.11.2015

—
Ведущая организация
Название: ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур»
ФИО руководителя, заверившего отзыв: Пивоваров В.Ф.
№ протокола и дата: №1 от 27.11.2015
Отзыв организации: положительный
Дата публикации отзыва: 30.11.2015

—
Другие отзывы на автореферат и диссертацию:

1. Отзыв 01 Лапина
2. Отзыв 02 Рожмина
3. Отзыв 03 Замятин
4. Отзыв 04 Цаценко
5. Отзыв 05 Виноградов
6. Отзыв 06 Соколова
7. Отзыв 07 Сорокопудова
8. Отзыв 08 Борисова
9. Отзыв 09 Булдаков

Актуальность. Представители рода Pelargonium L’Her относятся к  одной из самых распространенных цветочных культур. Отсутствие проблем с размножением и нетребовательность к условиям выращивания достаточно быстро сделали ее одним из самых любимых комнатных растений. Сегодня  тысячи высокодекоративных сортов пеларгоний (зональных, крупноцветковых, плющелистных, душистых, уникумов, и ангелов) используются в озеленении городов всего мира [28-32].

Пеларгония королевская (Pelargonium  grandiflorum (Andrews) Willd.) является  важнейшей горшечной цветочной культурой в России, на нее приходится более 15 % рынка декоративных растений [95]. В этот вид растений входят самые эффектные и изысканные сорта, которые обладают мощным, но не обязательно высоким «кустом» с прямыми, ровными побегами, крупными зазубренными складчатыми листьями и огромными цветками, достигающими размера до 7 см. Окраска яркая, двухцветная или пятнистая [98]. Пеларгония королевская представлена в основном сортами немецкой и голландской селекции [30].

В нашей стране опубликовано несколько монографий [50,51,95,98] по культуре представителей рода Pelargonium. В основном в них затрагиваются вопросы ассортимента и агротехнических приемов выращивания различных групп пеларгоний в условиях закрытого грунта [29]. В последние годы появились публикации [28-32] о  начале  селекционных  работ по  созданию гибридов пеларгонии королевской для открытого грунта с целью озеленения садов и парков Черноморского побережья. Таким образом, отсутствие сортов отечественной селекции подтверждает актуальность селекционных исследований данной культуры.

Для получения новых конкурентоспособных отечественных сортов с высокими декоративными качествами, а также устойчивыми к болезням и вредителям необходимо создание нового исходного материала. Использование биотехнологических подходов в селекции пеларгонии королевской позволит значительно уменьшить затраты времени и средств на выведение новых сортов и изменить акценты в селекционном процессе.

К наиболее перспективным методам ускорения селекционного процесса относится метод гаплоидии, интерес к которому все более возрастает в последнее время, когда с особой остротой встал вопрос сокращения сроков выведения новых сортов и гибридов, наиболее полно отвечающих современным требованиям производства [17].  Применение гаплоидов  в селекции позволяет быстрее найти нужную комбинацию, обнаружить рецессивные мутации, и как следствие выявить ценные признаки, создавать стабильные гомозиготные линии [4,5,9,10,56,58,95] для получения которых традиционными методами гибридизации и отбора требуется длительный инбридинг [189]. С  помощью культуры пыльников и микроспор (андрогенез in vitro) от гибридных растений первого поколения, можно получать гомозиготные растения в первой генерации и, таким образом, сократить селекционный процесс на 3-4 генерации, необходимые для обычной схемы селекции [17]. Мутации, возникающие на уровне гаплоидов — быстродоступны для отбора и диагностики [72]. Полученные удвоенные гаплоиды можно использовать непосредственно для создания сортов, либо в качестве исходного материала для последующей селекции путем вовлечения их в скрещивания.

Однако, несмотря на перспективы метода гаплоидии, использование его на представителях рода Pelargonium достаточно ограничено. Работы по культуре пыльников пеларгонии проводятся в Германии, Польше, Китае, Японии и других странах, но достигнутые результаты весьма ограничены: только у отдельных генотипов получены с небольшой частотой андрогенные новообразования  –  каллусы, эмбриоиды различного уровня плоидности и побеги-регенеранты, среди которых обнаружены удвоенные гаплоиды [100,101,120,121,232,249].  Это связано с тем, что в настоящее время не достаточно эффективно разработана система получения гаплоидов при культивировании пыльников и микроспор, не решены проблемы состава питательных сред и регуляторов роста для данной культуры, регенерации и других факторов, влияющих на  процесс  культивирования пыльников и микроспор in vitro  [100,101,103,120,121,232,249,260]. Недостаточно изученными являются вопросы, связанные с индукцией первичных андрогенных образований (каллусов, эмбриоидов), а также прямого и непрямого эмбриоидо- и каллусогенеза [100,125,192,249].

Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований является разработка технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской в культуре микроспор для последующего использования в селекционном процессе.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Выявить сорта пеларгонии королевской, наиболее подходящие для использования в культуре микроспор.
2. Изучить факторы, влияющие на культивирование микроспор in vitro и получение удвоенных гаплоидов.
3. Изучить особенности морфогенеза в культуре микроспор на питательных средах различного состава и установить оптимальные концентрации и соотношения регуляторов роста для индукции этого процесса.
4. Получить и оценить растения-регенеранты.
5. Разработать лабораторный технологический регламент получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор пеларгонии королевской.

Объект исследований: технология получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской в культуре микроспор.

Предмет исследований: бутоны, пыльники, микроспоры, эмбриоиды, растения – регенеранты пеларгонии королевской.

Научная новизна работы: Впервые в России разработана технология, позволяющая получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды пеларгонии королевской в культуре микроспор.

В результате проведённых исследований оптимизированы факторы, влияющие на культивирование микроспор пеларгонии королевской in vitro:

• установлена оптимальная длина бутона пеларгонии королевской – 10 мм, содержащая невакуолизированные микроспоры, обладающие морфогенетической активностью;
• установлено, что для индукции андрогенеза в культуре пыльников и микроспор пеларгонии королевской не требуется воздействия шоковыми температурами, что позволяет исключить из технологии предварительное выдерживания пыльников при шоковых температурах;
• определена оптимальная питательная среда MS, содержащая сахарозу — 120 г/л, аскорбиновую кислоту — 100 мг/л, агар – 5 г/л для эмбриоидогенеза микроспор пеларгонии королевской in vitro;
• установлены оптимальные концентрации и соотношения регуляторов роста для индукции прямого эмбриоидогенеза [0,25 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP]; [0,5 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP]; [4 мг/л BAP + 0,3 мг/л НУК] и непрямого эмбриоидогенеза [2 мг/л BAP + 0,1 мг/л НУК].

Проведена оценка с помощью RAPD-анализа полученных растений-регенерантов, в результате которой установлена их генетическая гетерогенность в сравнении с исходными сортами. С помощью цитологического анализа доказана гаплоидная природа растений-регенерантов пеларгонии королевской, полученных в культуре микроспор. Получены гаплоиды и  удвоенные  гаплоиды.

Практическая ценность.

1. Разработана технология получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской, которая может быть применена и к другим представителям рода Pelargonium.
2. Элементы технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской в части получения маточных растений и клонального микроразмножения ценного селекционного материала используются в работе тепличного комбината ООО «ПО Егорьевское».
3. Получены удвоенные гаплоиды пеларгонии королевской сортов Лотос, Шоко, Петтикот, которые могут быть использованы в селекционном процессе данной культуры.

Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.

Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации были доложены на VIII Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 2-5 октября 2012 г.); XI Международной научно-практической конференции «Становление современной науки -2015» (г. Прага. Чехия, 20-30 сентября 2015 г.).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Определение оптимальной длины бутона, содержащую невакуолизированные микроспоры;
2. обоснование необходимости предварительного выдерживания пыльников при пониженных и повышенных температурах;
3. разработка состава питательных сред и оптимальных концентрации и соотношения регуляторов роста для индукции прямого и непрямого эмбриоидо- и каллусогенеза;
4. сорта пеларгонии королевской, характеризующиеся высоким андрогенным потенциалом in vitro;
5. растения-регенеранты (R₁) пеларгонии королевской, полученные на основе удвоенных гаплоидов, характеризующиеся высокой выравненностью по декоративным и хозяйственно-ценным признакам.

Личный вклад соискателя: автор осуществил планирование исследования, сформулировал его цель и задачи, провел обзор литературе по тематике диссертации. В ходе выполнения работы лично проводил исследования в экспериментах in vitro и in vivo. Эффективно применил методы статистической обработки и анализа полученных результатов исследований, сформулировал выводы и разработал практические рекомендации. Все научные положения, представленные в диссертации, автором получены лично.

Внедрение результатов в практику: результаты исследований, включающие получение и размножение маточных растений, элементов технологии клонального микроразмножения пеларгонии королевской внедрены в работу тепличного комбината ООО «ПО Егорьевское» (Московская область, Егорьевский район, поселок Новый, Промзона 9).

Публикации результатов исследований:

По результатам исследований по теме диссертации опубликовано  4  работы, в том числе две в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 170 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 23 рисунками и  состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, предложений для использования в селекционной практике, приложения и списка использованных источников, содержащего 269 наименование, в том числе 168 иностранных авторов.